原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長，既有上皮樣細胞又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等。混雜的細胞會直接影響實驗結果。

在體外(wai)培(pei)養原代細(xi)(xi)胞(bao)時，為了(le)保證(zheng)實(shi)驗結果的可靠(kao)性、一(yi)致性、穩定性、和可重復(fu)性，要求采用(yong)單一(yi)種類細(xi)(xi)胞(bao)來(lai)進行(xing)(xing)實(shi)驗，這樣(yang)才能對某一(yi)細(xi)(xi)胞(bao)的功能、形態等變化進行(xing)(xing)一(yi)系列研究(jiu)(jiu)，因而培(pei)養細(xi)(xi)胞(bao)的純化就(jiu)成為實(shi)驗研究(jiu)(jiu)的重要一(yi)步，甚至(zhi)需要從(cong)混雜的細(xi)(xi)胞(bao)群中分離出單個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)來(lai)進行(xing)(xing)培(pei)養和開展(zhan)實(shi)驗研究(jiu)(jiu)。

一、原代細胞增殖優勢純化方法：

自然純化是利用某一(yi)種類細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)增殖(zhi)優勢，在(zai)長期傳代過(guo)程中靠自然淘(tao)汰(tai)法，不(bu)斷排擠其(qi)他生長慢的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，靠自然增殖(zhi)的(de)(de)潛力，最后留(liu)下(xia)生長優勢旺盛的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，達(da)到(dao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)純化的(de)(de)目的(de)(de)。但這種方(fang)法常無法按照(zhao)需(xu)要(yao)和實(shi)驗(yan)要(yao)求(qiu)及(ji)研究目的(de)(de)來(lai)選擇細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。此法花費時間長，留(liu)下(xia)的(de)(de)往(wang)往(wang)是成纖維細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)。僅有那些惡變的(de)(de)腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)或(huo)突變的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)可以(yi)通過(guo)此方(fang)法而保留(liu)下(xia)來(lai)的(de)(de)，不(bu)斷純化而建立(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)系(xi)。

二、原代細胞常用純化方法：

人工純(chun)化是利用人為(wei)手段造成對某一細(xi)胞(bao)生長有(you)利的環境(jing)條件，抑制其他細(xi)胞(bao)的生長從而達到純(chun)化細(xi)胞(bao)的目(mu)的。

 1、細(xi)胞時間(jian)差酶消化法：

酶(mei)消化法是(shi)比(bi)較常用的純化方法，不僅(jin)對貼(tie)壁細(xi)胞(bao)可行，能利用上皮細(xi)胞(bao)和成(cheng)纖維細(xi)胞(bao)對胰(yi)蛋白酶(mei)的耐(nai)受性不同，是(shi)兩者分(fen)開(kai)，達到純化的目(mu)的；另外對貼(tie)壁細(xi)胞(bao)與半貼(tie)壁細(xi)胞(bao)及黏(nian)附細(xi)胞(bao)間的分(fen)離純化也(ye)是(shi)十分(fen)有效的。

兩者在胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)的(de)作用下，由(you)于成纖(xian)維細(xi)胞(bao)(bao)先脫壁，而上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)要(yao)消化(hua)相(xiang)當長(chang)的(de)時間才脫壁，特別是在原代細(xi)胞(bao)(bao)初次(ci)傳(chuan)代和早期傳(chuan)代中(zhong)兩種差(cha)別尤為明顯(xian)，故可(ke)采用多次(ci)差(cha)別消化(hua)方法將(jiang)上(shang)皮(pi)細(xi)胞(bao)(bao)和成纖(xian)維細(xi)胞(bao)(bao)分開，方法步驟(zou)如下：

采(cai)用常規消化傳代方式將0.25%胰蛋(dan)白(bai)酶注(zhu)入培養瓶內兩次(ci)，每(mei)次(ci)加(jia)1ml（25ml培養瓶），來回輕(qing)搖(yao)1-2次(ci)，使胰蛋(dan)白(bai)酶流(liu)過所有細胞(bao)表面，然(ran)后(hou)倒(dao)掉。

蓋好(hao)瓶塞，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶放在倒(dao)置顯微鏡下觀察，發現(xian)成纖維細胞變園，部分脫落(luo)，立(li)即加(jia)入2ml有(you)血(xue)清(qing)的培(pei)養(yang)基終止消化。

用彎頭吸管輕輕吹打(da)成纖(xian)維細(xi)胞生長區域（可事(shi)先在鏡下用記號筆在培養(yang)(yang)瓶(ping)(ping)上劃出記號）。吹打(da)時不要用力，也不要吹打(da)上皮細(xi)胞生長區域。吹打(da)結束(shu)后，再(zai)用少量培養(yang)(yang)基漂洗(xi)一(yi)遍，然后加入適量培養(yang)(yang)基于瓶(ping)(ping)內繼(ji)續培養(yang)(yang)，也可重(zhong)復上述操作再(zai)進行一(yi)次(ci)。

隔幾(ji)日后或下(xia)次傳代時(shi)，再進(jin)行(xing)上述操作，進(jin)過幾(ji)次處理，就可(ke)將(jiang)成纖維細(xi)胞去除或者(zhe)將(jiang)兩者(zhe)分開。

2、細(xi)胞培養機械刮除法(fa)：

原(yuan)代培養時，如果上皮細胞(bao)和成纖(xian)維(wei)細胞(bao)分為區成混雜生(sheng)長(chang)，每種細胞(bao)都以(yi)小(xiao)片或(huo)區域(yu)性(xing)分布的(de)(de)方式生(sheng)長(chang)在瓶壁上。可采用機械的(de)(de)方法去除(chu)不(bu)需要的(de)(de)細胞(bao)區域(yu)而保留需要的(de)(de)細胞(bao)區域(yu)，其方法步驟如下 ：

將(jiang)要純化細胞的培養瓶，在凈化室內放在倒置(zhi)顯微鏡監視下進行操作。

用硅橡(xiang)膠刮子在不需要生長的細胞區域推(tui)劃，使細胞懸(xuan)浮在培(pei)養基中，注(zhu)意不要傷(shang)及所(suo)需細胞。

推劃后用培(pei)(pei)養(yang)基(ji)沖洗振搖(yao)兩(liang)次倒掉，即可將培(pei)(pei)養(yang)基(ji)加入(ru)原瓶繼續培(pei)(pei)養(yang)。

數日后如發現不需要的細胞又長出，可再進行上述操(cao)作，這樣反復多次可以純化細胞。操(cao)作過程中要嚴格無菌操(cao)作，防止污(wu)染。

3、細胞反復貼壁法：

成纖維細胞(bao)與上皮細胞(bao)相比(bi)，其貼壁(bi)過(guo)程快，大部分(fen)細胞(bao)能在短時間(jian)內(nei)（大約10-30min）完成附著過(guo)程（但不一(yi)定*伸展），而(er)上皮細胞(bao)（大部分(fen)）在短時間(jian)內(nei)不能附著或附著不穩(wen)定，稍加振蕩即浮(fu)起(qi)，利用(yong)此差別可以純化細胞(bao)。

將細胞懸液接種在(zai)一個培養(yang)內(nei)（最好培養(yang)基(ji)內(nei)不含血清，此(ci)時上皮細胞貼壁(bi)更慢）靜置20min。

在倒置顯微鏡下觀察(cha)，見部分(fen)細胞貼壁，稍加搖動也不浮起時(shi)，將(jiang)細胞懸液導入另一培養瓶中。

繼續靜(jing)置培養20min，然(ran)后重復(fu)上述操作后，即(ji)可(ke)將上皮(pi)(pi)細胞(bao)和(he)成纖維細胞(bao)分隔開(kai)，在第(di)一瓶和(he)第(di)二瓶以(yi)成纖維細胞(bao)為(wei)主(zhu)，往后幾(ji)瓶即(ji)以(yi)上皮(pi)(pi)細胞(bao)為(wei)主(zhu)，下次傳代時再按上述方法處理(li)，就可(ke)使兩者達到(dao)*分開(kai)的(de)目(mu)的(de)。

4、細胞(bao)電(dian)烙(luo)篩選法：

在貼壁細(xi)胞轉(zhuan)化(hua)時，往往在培養瓶的(de)(de)細(xi)胞層中會出現分(fen)散(san)的(de)(de)轉(zhuan)化(hua)灶，轉(zhuan)化(hua)灶區域細(xi)胞密集、排列規則(ze)，有明顯生長趨(qu)勢(shi)，與周邊未能轉(zhuan)化(hua)的(de)(de)細(xi)胞有明顯的(de)(de)區域界(jie)限，此時即(ji)可用機械刮除法(fa)取出未轉(zhuan)化(hua)細(xi)胞，也可用電烙篩選法(fa)燙死(si)未轉(zhuan)化(hua)細(xi)胞而保留轉(zhuan)化(hua)灶細(xi)胞。

倒去原液，并用記號筆(bi)劃出轉化灶的區域(yu)。

用(yong)(yong)(yong)加熱(re)的(de)(de)(de)微型(xing)電烙器（類似焊(han)接用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)電烙鐵）將轉(zhuan)化(hua)灶(zao)周邊(bian)的(de)(de)(de)細胞全部燙死，只保留轉(zhuan)化(hua)灶(zao)細胞。在單細胞克隆篩選(xuan)時，也可用(yong)(yong)(yong)此(ci)法(fa)將單個細胞周圍的(de)(de)(de)細胞殺死。

然后(hou)在適應(ying)性培養基中（50%是(shi)原液）繼續培養，即(ji)可達到純化的(de)目(mu)的(de)。